Science前沿综述解读︱烟碱型乙酰胆碱受体辅助分子的调节机制及疾病治疗转化应用前景

撰文︱Sucre

责编︱王思珍

乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）及其受体在机体生理功能和病理过程中均扮演着极为重要的角色。生理方面，ACh作为一种重要的神经递质，通过与不同的受体作用，发挥相应的生理功能，比如通过与烟碱型ACh受体（nicotinic ACh receptors，nAChRs）作用，介导多种生理过程，包括肌肉收缩、神经传递、感觉传导等。药理方面，nAChRs是烟草成瘾的关键机制，同时也是高血压和痴呆等疾病的重要治疗靶点【1】。

然而，一直以来，由于我们对nAChRs的生物合成、折叠组装、运输过程和功能活化的机制理解有限，以及功能性nAChRs在重组细胞中表达受阻，极大地阻碍了针对nAChRs的基础研究和药物开发的进程。

近日，来自美国强生制药公司的David S. Bredt团队在Science上发表了题为Nicotinic acetylcholine receptor redux: Discovery of accessories opens therapeutic vistas 的最新综述文章。在该综述中，作者系统回顾了多种烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）在亚基合成、折叠组装、胞膜运输和功能活化过程中，涉及多种辅助蛋白分子的紧密配合。这些辅助分子的发现，不仅有助于加强我们对nAChRs生物合成、运输、及生物功能的理解，同时也为因nAChRs功能异常导致的相关疾病，开辟新的研究领域和治疗方向。

背 景 简 介

一、乙酰胆碱的发现

1921年，Otto Loewi将两个跳动的蛙心脏分离后，分别置于任氏液中，其中第一个心脏连有迷走神经，另一个心脏去除迷走神经。电刺激第一个心脏的迷走神经，发现受其支配的心脏跳动速率下降，随即将其中的任氏液吸出并滴加到另一个去除迷走神经的心脏中，结果发现该心脏的跳动速率同样下降，为此，Otto Leowi推测神经通过其末梢释放出特殊的活性物质支配心脏活动，并将其中可转移的物质称为“迷走神经素”（Vagusstoff），即为经典的“双蛙心灌流实验”。随后1929年，Henry Dale和H.W. Dudley从公牛和马的脾脏中分离并鉴定这种活性物质为乙酰胆碱（acetylcholine）【2-3】。由于上述开创性工作，Otto Leowi和Henry Dale于1936年共同获得诺贝尔生理学或医学奖，从此也揭开了乙酰胆碱的研究序幕。

二、乙酰胆碱受体介导的生物功能简介

乙酰胆碱通过与乙酰胆碱受体作用发挥功能。乙酰胆碱受体分为毒蕈碱型受体（muscarinic Ach receptor）和烟碱型受体（nicotinic Ach receptor，nAChR），前者为G蛋白偶联型受体，后者为离子通道型受体。鉴于nAChR是第一个分离出来的神经递质受体，同时在神经传导中扮演着重要角色，为此，在这篇综述中，作者重点关注了nAChR。nAChR广泛分布在脑、肌肉、淋巴细胞和耳蜗毛细胞等组织中，分别调节认知、肌肉收缩、免疫调节和听觉辨别等生理功能。

此外，nAChR在多种病理过程中也发挥重要作用，比如尼古丁（nicotine）的成瘾作用与nAChRs介导的奖赏作用密切相关【4】。nAChR亚基突变能够导致多种遗传性疾病，比如癫痫和神经肌肉接头障碍等。nAChR多态性与肺癌发生相关。因此，鉴于nAChRs在正常生理功能和病理过程中的重要作用，nAChR也逐渐成为治疗和开发心血管、精神和认知障碍等疾病的重要靶点【5】。

三、烟碱型型乙酰胆碱受体结构

所有的nAChRs结构类似，是由5个亚基组成的五聚体结构，每个亚基包含一个N端胞外结构域，用于配体结合，接着是四个跨膜区（transmembrane，TM）。在TM3和TM4之间，是一个大的胞质区，由两个结构化的螺旋MX和MA组成，调节与细胞骨架锚定蛋白的相互作用。目前已知的参与nAChRs形成的亚基分别是：9个α（α2-α10）亚基、3个β（β2-β4）亚基、1个γ亚基、1个δ亚基、以及1个ε亚基。其中神经元中的nAChRs主要由多种α2-α9和β2-β4亚基组合形成【6】。

研 究 进 展

细胞内nAChRs的生物合成涉及高度复杂且精确调控的过程。多种分子伴侣和辅助蛋白在亚基合成、折叠组装、胞膜运输和受体功能活化等过程中的作用，是实现nAChRs正常行使生理功能的关键因素。

一、肌肉组织中的nAChRs

运动神经元兴奋释放ACh，通过作用于骨骼肌上的nAChRs，引起肌肉兴奋和收缩。然而，ACh-nAChRs连接异常能够导致多种疾病的发生。比如，参与nAChRs形成的基因突变是导致先天性性肌无力综合征的主要原因；自身抗体与神经肌肉接头中的蛋白（乙酰胆碱受体、肌肉特异性受体、肌联蛋白等）结合，诱发炎症反应，引起nAChRs耗竭，是导致重症肌无力的重要机制【7】。

目前针对nAChR水平下降引起的肌无力，主要采用胆碱酯酶（cholinesterase）抑制剂以提高突触中乙酰胆碱的水平。然而胆碱酯酶抑制剂的疗效相对缓和，因此目前急需更好的治疗方式。比如通过基因治疗替换先天性肌无力患者的突变基因，是一种潜在的治疗方法。在重症肌无力中，虽然阻断自身免疫过程是一种有效的治疗手段，但该方法需要进行终身免疫抑制治疗。

增强nAChR组装和促进nAChRs细胞表面表达，在概念上为某些肌无力患者提供了新的治疗策略。人们对肌肉中nAChRs形成过程的构象成熟和亚基寡聚化已有了系统的认识和理解。通过正向遗传筛选的方法，从秀丽隐杆线虫中鉴定出CRELD1蛋白，研究发现该分子能够促进nAChRs的组装与合成，并且在进化上具有保守性，因此CRELD1是一种潜在的肌无力治疗靶点【8】。此外，通过增强MuSK信号通路，以促进突触中nAChR聚集，旨在治疗神经肌肉连接障碍的药物目前也正在开发中。

图1 功能性受体表达的辅助分子筛选流程：功能生物实验筛选可增强受体活性的蛋白质

（图片引自：Matta JA, Gu S, et al., Science. 2021）

二、NACHO作为神经元nAChRs的特异性分子伴侣

将肌肉中的nAChRs表达在异源细胞系中，可以形成有功能活性的通道。截然不同的是，将神经元中的nAChRs表达在异源细胞系中却没有功能活性。通过全基因组表达克隆的方法（图1），发现一种神经元特异的内质网驻留蛋白，NACHO，介导神经元中α7 nAChRs的组装，同时这一研究也揭示了神经元nAChRs在非神经元细胞中无法形成功能性受体的原因。NACHO主要通过协同N-寡糖转移酶（OST）、钙联蛋白、RIC3和抗凋亡Bcl-2蛋白参与α7 nAChRs的α7亚基折叠、组装和胞膜运输过程【9】。此外，NACHO也参与其他nAChRs的生物发生和功能发挥，比如α4β2 nAChRs和α6β2β3 nAChRs。随后，研究发现，NACHO敲除的小鼠表现出运动过度活跃和认知功能障碍，同时这一结果与nAChR表达异常引起的表型相符，而其他类型受体的活性，比如，GABA_A、5-HT3A、AMPA和TRPV1表现正常。因此NACHO是神经元nAChRs的特异性分子伴侣（图2）。

图2 α7 nAChRs 和α4β2 nAChRs的组装、运输和活化机制

（图片引自：Matta JA, Gu S, et al., Science. 2021）

三、药物和代谢产物对nAChR组装的调节

一些小分子可以调节nAChR的组装。基于作用机制，这些化合物可以分为三类。第一类是正构配体，主要参与亚基中Ach结合口袋的形成和成熟nAChRs的稳定。第二类包括薄荷醇（menthol）和多胺（polyamines），它们可以直接结合到nAChRs的非正构结合位点，从而调节受体的组装。第三类是一些较为常见的参与蛋白折叠的分子，它们一般不直接作用于AChRs，主要包括4-苯基丁酸（4-phenylbutyrate）、丙戊酸钠（valproate）、丁酸盐（butyrate）等，它们也是脱乙酰化酶（histone deacetylase ）的抑制剂。

上世纪八十年代，人类首次研究发现，吸烟者大脑中nAChR水平升高【10】。接着，研究发现，在动物实验中，尼古丁不仅能够促进nAChR的功能，同时可以提升nAChR的转录后水平。这与我们常见的一些G蛋白偶联受体（比如阿片类受体）截然不同：在长期暴露于激动剂后，表达水平会下调。机制上，尼古丁与配体结合位点的相互作用促进了nAChR五聚体的形成和受体的表面表达 ，这些作用与受体的激活无关。

在脑组织中，尼古丁的强化属性是由中脑缘的含有β2亚基的nAChRs介导，因此，nAChR的上调很可能参与尼古丁成瘾。薄荷醇也可以上调脑中的nAChRs水平。转基因小鼠中，薄荷醇能够增加多巴胺神经元中含有α4和α6亚基的nAChR的组装【11】。因此，奖赏环路中，nAChRs表达水平上升也许能解释薄荷醇香烟吸食者相比非薄荷醇香烟吸食者更难戒烟的原因。

此外，配体介导的组装可能在某些nAChRs的成熟过程中也扮演重要角色。全基因组筛选促使α9α10 nAChRs正常发挥功能的因子，并鉴定出乙酰胆碱的生物合成酶，即胆碱乙酰转移酶（ChAT）。ChAT介导的α9α10亚基组装反映出Ach的分子伴侣作用【12】。由于Ach不能有效地穿过细胞膜，因此暗示Ach可能通过胞外机制，促进α9α10 nAChR的组装。事实上，即使细胞外施加α-环蛇毒素（不能透过细胞膜），同样能够提高α9α10的水平。因此这种由Ach通过胞外介导的组装机制可能有助于功能性α9α10亚基受体在Ach释放位点的定位。

借助cDNA表达克隆技术（图3），鉴定出增强α4β2表面运输的分子SAT1。SAT1是聚胺分解代谢的限速酶，提示这些普遍存在的线性聚合阳离子可以抑制α4β2的表达。的确，阻断聚胺的合成能够提升功能性α4β2亚基和α7亚基受体的水平。此外，SAT1的基因多态性与自杀行为有强的相关性。因此，这些研究结果为进一步评估烟碱制剂作为治疗自杀行为的药物，提供了新的证据。

图3 功能性受体表达的辅助分子筛选流程：高内含量成像技术筛选可促进受体转运的蛋白质  

（图片引自：Matta JA, Gu S, et al., Science. 2021）

四、辅助蛋白对nAChR功能的调节作用

蛋白分子伴侣主要功能是帮助nAChR受体的组装和转运，而辅助分子则主要是稳定受体和控制通道功能。在线虫中，先后报道了两种nAChR辅助分子，MOLO-1和 EAT-1，二者分别参与nAChRs的功能活化和功能性表达，且两者均为单次跨膜蛋白【13-14】。

类似地，多种哺乳动物nAChRs的生物合成也有辅助分子的参与。研究发现纹状体中α6β2β3 nAChR受体的组装转运、功能活化涉及多种辅助分子的参与。α6β2β3 nAChRs是一种芋螺毒素MII敏感的突触前受体。然而，NACHO敲除小鼠的纹状体中，芋螺毒素MII受体结合位点减少。此外，在HEK293细胞系中，NACHO共转染能够促进寡聚体的组装，但是不能表达功能性的α6β2β3 nAChR受体。进一步地，利用全基因组筛选的方法，鉴定出SULT2B1，LAMP5和BARP通过协同NACHO重建α6β2β3 nAChR通道蛋白的功能。具体来说，NACHO促进α6β2β3 nAChRs的组装，LAMP5和SULT2B1促进受体的细胞表面转运，BARP增强受体通道的活性【15】（图4）。

图4 中脑多巴胺神经元α6β2β3 nAChRs功能的调节机制

（图片引自：Matta JA, Gu S, et al., Science. 2021）

不同nAChRs的功能性重组涉及不同辅助蛋白的参与。α6β4 nAChRs主要分布在背根神经节的感觉神经元中，在药理上具有重要的潜在价值。与α6β2β3 nAChRs不同的是，α6β4 nAChRs的功能性重组需要BARP和IRE1α辅助分子的参与，而不受NACHO影响【16】（图5）。IRE1α是一种未折叠蛋白响应的传感器（sensor）。α6β4亚基是神经性疼痛的潜在治疗靶点。

图5 背根神经节感觉神经元α6β4 nAChRs 功能的调节机制

（图片引自：Matta JA, Gu S, et al., Science. 2021）

类似的，α9α10 nAChR的功能性组装也需要特定的辅助蛋白参与。通过全基因组表达克隆的方法，鉴定出TMIE和TMEM132E是α9α10 nAChR功能性组装的重要辅助分子。TMIE和TMEM132E都是单次跨膜蛋白，并且都在非综合征性耳聋中发生隐性突变【17-18】（图6）。上述这些研究表明了nAChRs功能调节的多元化。

图6耳蜗毛细胞α9α10 nAChR的组装

（图片引自：Matta JA, Gu S, et al., Science. 2021）

此外，许多强亲和力毒素（prototoxin）能够与不同的nAChRs稳定结合，从而影响相应nAChRs的生理功能。比如，强亲和力毒素lynx1影响α4β2 nAChRs的组装【19】，lynx2抑制α4β2 nAChRs和α7 nAChRs的生理功能【20】，强亲和力毒素靶向nAChRs的多样化作用，为临床开展针对精神、疼痛等疾病的治疗性干预提供了新的可能和方向。此外，强亲和力毒素如何与nAChR受体辅助分子，如NACHO和14-3-3等，功能性地相互作用，也是未来一个很有意思的研究方面。  

五、辅助成分对nAChR神经生物学方面的影响

结合以上内容，多个分子和信号通路参与nAChRs的功能调节。有些是小分子，有些是蛋白小分子，它们或参与调控受体的生物合成，或参与调节通道的活化。值得注意的是，不同类型的nAChRs对辅助分子具有选择性，比如NACHO和BARP能够调节多种nAChRs，而TMIE、TMEM132e和IRE1a仅能影响单个nAChR类型。同时有些nAChRs的功能性表达需要多种辅助分子参与（表1）。这种选择性和复杂性，一方面反映了nAChRs在特定组织类型、细胞特定位置的有序表达需要不同分子之间的精准协调，另一方面也为nAChRs在机体中广泛参与的生理功能奠定了分子基础。

表1 参与调节nAChRs生物合成与功能的辅助分子

（表格引自：Matta JA, Gu S, et al., Science. 2021）

六、辅助成分对nAChR神经药理学方面的影响

实现nAChRs的功能性表达为多种疾病，比如慢性疼痛、帕金森病和听力障碍等的药物开发提供了可能。研究发现，来源于青蛙皮肤的生物碱，地棘蛙素（epibatidine），是一种普遍存在的nAChR激动剂，目前是一种强效镇痛药【21】。此外，一种pan-nAChR激动剂ABT-594，针对糖尿病肾病具有很好的疗效，目前处于临床二期试验中，然而其靶向nAChR的作用机制尚不清楚。

随后，对非亲缘系小鼠背根神经节进行基因组筛选发现， nAChR α6亚基的mRNA水平与非神经损伤性小鼠模型中的疼痛反应呈负相关。此外，研究发现α6敲除的小鼠，尼古丁在炎症和神经病理性损伤后的镇痛作用均消失。另有研究发现，人类术后疼痛和颞下颌关节紊乱综合征受CHRNA6（α6）启动子多态性的影响。因此α6β4可能是治疗慢性疼痛的潜在靶点。通过BARP和IRE1α实现人类α6β4的功能性重组表达，为针对该靶点的药物开发重新开辟了道路【22】。

另外两个具有潜在治疗价值的nAChRs分别是α6β2β3 nAChR和α9β10 nAChR。得益于它们在哺乳类动物细胞中顺利表达，因此极大地促进了针对相应受体的生化性质研究以及高通量药物筛选和开发。

大脑中α6β2β3 nAChR受体丰富表达于中脑边缘系统的神经元突触前神经末梢；同时，在纹状体和伏隔核中，α6β2β3 nAChRs介导由乙酰胆碱和烟碱诱导的多巴胺释放。因此这使得α6β2β3 nAChRs成为治疗帕金森病、精神分裂症和药物成瘾的潜在靶点。

α9β10 nAChR在成年耳蜗的外耳毛细胞中表达丰富，并介导来自上橄榄复合体（superior olivary complex）的信息传入。传入信号通过负反馈机制，降低外耳毛细胞的放大作用，这一过程有效提升背景噪声中的信号分辨能力，同时也保护听力免受声音损伤【23】。此外，研究发现负反馈机制异常很可能与耳鸣的病理发生相关。因此，α9β10 nAChR的功能性表达不仅将为药物开发开辟了新的道路，同时也为听力障碍提供了新的治疗方向。

其他一些重要的nAChR，比如，含有α2或α5亚基的nAChR，仍然在重组细胞系中难以表达，并且缺乏选择性作用的药物，为开展深入研究带来了不少困难。α2β2 nAChR受体在海马OLM（oriens lacunosum-moleculare）神经元中表达，并且参与烟碱引起的突触可塑性，因此α2β2 nAChR是治疗认知功能障碍的潜在靶点【24】。值得注意的是，在所有人类单核苷酸多态性中，α5 nAChR亚基（CHRNA5）的基因多态性在决定人类寿命方面仅次于ApoE4。

总 结 与 望 展

ACh-nAChRs在机体的生理、病理过程中均扮演者重要的角色。nAChRs广泛分布在脑、肌肉、淋巴细胞和耳蜗毛细胞等组织中，分别介导认知、肌肉收缩、免疫调节和听觉辨别等生理功能。此外，nAChRs在耳聋、成瘾、癌症、精神病、心血管、高血压等疾病方面也发挥着重要作用（图7）。

图7 nAChRs的组织分布、生理功能及生物合成

（图片引自：Matta JA, Gu S, et al., Science. 2021）

如果说“迷走神经素”（乙酰胆碱）和nAChRs的发现，打开了我们对ACh-nAChRs认识的大门，那么辅助分子的发现，则代表着我们对nAChRs生物学认识转折的开始。

nAChRs种类多样，组成复杂，不同类型的nAChRs的组成亚基不同，某些特定类型的nAChRs组装或活化需要特定的辅助蛋白参与，而某些辅助蛋白则可以参与多种nAChRs的合成过程，比如NACHO和BARP能够调节多种nAChRs，而TMIE、TMEM132e和IRE1a仅能影响单个nAChR类型。此外，目前仍然有多种重要的nAChRs在重组细胞系中难以表达，并且缺乏选择性作用的药物，为深入开展相关受体的研究带来了不少困难。

随着nAChRs生物合成过程中辅助分子的发现，逐渐加深了我们对nAChRs生物合成过程的理解，具体来说，即多种小分子或蛋白在nAChRs的亚基合成、折叠组装、胞膜转运和功能活化过程中发挥调控作用。这一过程的深入研究，为相关疾病的研究提供了更多可以干预的治疗靶点。

nAChRs生物合成、转运、及生物功能的复杂性，以及nAChRs辅助分子对这些过程的精细调控，共同奠定了nAChRs及辅助分子广泛参与机体生理、病理、及药理过程的分子基础。同时，也共同为开发特异性疾病干预治疗提供了有利条件，包括精神疾病、神经系统疾病、听觉障碍等。

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原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abg6539

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制版︱王思珍

本文完